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食用色素按其来源可分为食用天然色素和食用合成色素两大类。食用色素食用天然色素是人工从有色的动、植物体内提取,合成经进一步分离精制而成。测定合成色素因其着色力强,食用色素易于调色,人工在食品加工过程中稳定性能好,合成价格低廉,测定在食用色素中占主要地位。食用色素目前,人工国内外使用的合成食用色素绝大多数都是食用合成色素。合成色素主要来源于煤焦油及其副产品,测定且在合成过譬皇?食用色素能受铅、砷等有害物质污染,人工因此在使用的合成安全性上,其争论要比其他类的食品添加型要岁突出和尖锐。中国许可使用的合成色素有9种:苋菜红、胭脂红、诱惑红、新红、柠檬黄、日落黄、靛蓝、亮蓝、赤藓红。前6种为偶氮类化合物,使用中占绝大多数。食用合成色毒的测定方法主要有薄层色谱法和高效液相色谱法。下面介绍高效液相色谱法测定食用合成着色剂。
1、原理
食品中人工合成着色剂用聚酰胺吸附法或液-液分配法提取,制成水溶液,注入高效液相色谱仪,经反相色谱分离,根据保留时间定性,与峰面积比较进行定量。
2、试剂
①盐酸。
②乙酸。
③正己烷。
④甲醇:经滤膜(O.5μm)过滤。
⑤酰胺粉(尼龙6):过200目筛。
⑥乙酸铵溶液0.02m01/L。称取1.54g乙酸铵,加水至1000mL溶解,经0.45μm滤膜过滤。
⑦水取2mL氨水,加水至100mL混匀。
⑧水一乙酸铵溶液0.02mol/L。取氨水0.5mL加乙酸铵溶液(O.02mot/L)至1000mL混匀。
⑨甲醇一甲酸溶液6+4。取甲醇60mL,甲酸40mL混匀。
⑩柠檬酸溶液:取20g柠檬酸(C6H807·H20)加水至100mL,溶解混匀。
⑪无水乙醇-氨水-水溶液7+2+1。取无水乙醇70mL、氨水20mL、水lOmL混匀。
⑫三正辛胺正丁醇溶液 5%。取三正辛胺5mL,加正丁醇至100mL混匀。
⑬饱和硫酸钠溶液。
⑭硫酸钠溶液:2g/L。
⑮pH6的水水加柠檬酸溶液调pH6。
⑯合成着色剂标准溶液准确称取按其纯度折算为100%质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝各0.100g,置于lOOmL容量瓶中,加pH6的水到刻度,配成水溶液(1.00mg/mL)。
⑰合成着色剂标准使用液 临用时将上述溶液加水稀释20倍,经0.45μm滤膜过滤。配成每毫升相当于50.0μg的合成着色剂。
3、仪器
高效液相色谱仪,带紫外检测器,254nm波长。
4、操作方法
(1)样品处理
①橘子汁、果味水、果子露汽水等:称取20.O~40.Og放入100mL烧杯中。含二氧化碳样品加热驱除二氧化碳。
②配制酒类:称取20.0~40.0g放入100mL烧杯中,加入小碎瓷片数片,加热驱除乙醇。
③硬糖、蜜饯类、淀粉软糖等:称取5.00~10.OOg,粉碎样品,放入100mL小烧杯中,加水30mL,温热溶解,若样品溶液pH较高,用柠檬酸溶液调pH至6左右。
④巧克力豆及着色糖衣制品:称取5.00~10.OOg,放入100mL小烧杯中,用水反复洗涤色素,至巧克力豆无色素为止,合并色素漂洗液为样品溶液。
(2)色素提取
①聚酰胺吸附法:样品溶液加柠檬酸溶液调pH为6,加热至60℃,将1g聚酰胺粉加少许水调成粥状,倒入样品溶液中,搅拌片刻,以G3垂熔漏斗抽滤,用60℃pH 4的水洗涤3~5次,然后用甲醇一甲酸混合溶液洗涤3~5次(含赤藓红的样品用液一液分配法处理)。再用水洗至中性,用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3~5次,每次5mL,收集解吸液,加乙酸中和,蒸发至近干,加水溶解,定容至5mL。经滤膜(O.45μm)过滤,取10μL进高效液相色谱仪。
②液-液分配法(适用于含赤藓红的样品):将制备好的样品溶液放入分液漏斗中,加2mL盐酸、三正辛胺正丁醇溶液(5%)10~20mL,振摇提取,分取有机相,重复提取,直到有机相无色,合并有机相,用饱和硫酸铵溶液洗两次,每次10mL,分取有机相,放蒸发皿中,水浴加热浓缩至10mL,转移至分液漏斗中,加60mL正己烷混匀,加氨水提取2~3次,每次5mL,合并氨水溶液层(含水溶性酸性色素),用正己烷洗两次,氨水层加乙酸调成中性,水浴加热蒸发至近干,加水定容至5mL。经滤膜(0.45μm)过滤,取10μL进高效液相色谱仪。
(3)高效液相色谱参考条件
①色谱柱:YWG-Cl810μm不锈钢柱4.6mm(内径)×250mm。
②流动相:甲醇-O.02m01/L乙酸铵溶液(pH 4)。
③梯度洗脱:甲醇20%~35%,5min;35%~98%,5min;98%继续6min。
④流速:1mL/min。
⑤紫外检测器:254nm波长。
(4)测定:取相同体积样液和合成着色剂标准使用液分别注入高效液相色谱仪,根据保留时间定性,外标峰面积法定量。
5、结果计算式中:
Xi——样品中着色剂的含量,g/kg;
Ci——样液中着色剂的质量,μg;
V2——进样体积,mL;
V1——样品稀释总体积,mL;
m——样品质量,g。
6、说明
①最小检出量:新红5ng,柠檬黄4ng,苋菜红6ng,胭脂红26ng。
②允许相对误差≤10%。
③样品不含赤藓红时,用聚酰胺吸附法;含赤藓红时,用液-液分配法
④测定一个样品后,将甲醇流动相恢复至20%,使之稳定20min后,再开始测定第二个样品。
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相关链接:苋菜红,诱惑红,柠檬黄,亮蓝
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